Resumo

Objetivos: Em trabalhos anteriores foi demonstrada a presença da enzima sintase de óxido nítrico (NOS) bem como da produção de NO em neurônios da retina. Também foi mostrada a produção de NO após a inibição da síntese de proteínas por cicloheximida (CHX) ou ativação de receptores NMDA, que ativa a eEF-2-cinase (eEF2-K) e fosforila o eEF-2 (um fator de tradução protéica). A inibição da síntese de proteínas aumentou as concentrações de L-Arg disponível no citoplasma e este aumento foi relacionado a uma maior produção de NO. Esta medida foi realizada indiretamente, através de imunocitoquímica e cromatografia para L-citrulina, o co-produto estequiométrico da síntese de NO. O presente trabalho teve por objetivo analisar o efeito da inibição da síntese protéica na medida direta de NO através do uso do composto 4-amino-5-metilamino-29,79-difluororesceína diacetato (DAF-FM-DA), que é absorvido pelas células por difusão simples e reage com esterases intracelulares, adquirindo uma forma iônica não difusível e capaz de reagir com o NO formando um composto triazolínico fluorescente com excitação/emissão máxima em 495/515 nm, e tornando possível a aquisição de imagens para a determinação da distribuição celular do NO bem como quantificar a fluorescência formada. Materiais e métodos: Culturas de células de retina de embrião de galinha de oito dias de desenvolvimento foram cultivadas por 6 dias em meio MEM em placas de 40mm ou de 20mm de diâmetro contendo lamínulas para microscopia. As culturas foram pré-incubadas por um período de uma hora com DAF-FM-DA (5&muM) e APV (50&muM, um antagonista de receptores NMDA) na presença ou ausência de L-NAME (250&muM, um inibidor da NOS). Após este período as culturas foram lavadas três vezes com Hanks’ e incubadas com salinas contendo glutamato (500&muM), CHX (350&muM), L-NAME (250&muM), CHX + L-NAME ou glutamato +L-NAME por mais uma hora. As culturas foram então fixadas com paraformaldeído 4%. Após 15 minutos, as lamínulas contendo as células foram retiradas, montadas lâminas e imediatamente fotografadas em microscópio de fluorescência. A fluorescência das imagens foi analisada pelo software ImageJ e sua quantificação foi estabelecida utilizando uma relação entre a intensidade dos pixels dividido pela área da imagem. A análise estatística dos dados foi realizada através do software GraphPad Prism 4.0. Resultados: A quantificação das imagens revelou um aumento na fluorescência de 177,7%± 37,8 (n=5) para a CHX e de 211,7%±10,7 (n=5) para o glutamato em relação ao controle. As fotomicrografias revelaram claramente uma maior quantidade de fluorescência em neurônios, e inesperadamente, nas células da glia em ambos os tratamentos. O aumento da fluorescência foi completamente abolido quando as células eram tratadas com L-NAME. Conclusões: Os dados revelam claramente que o a inibição da síntese protéica por CHX é capaz de aumentar diretamente a síntese de NO em neurônios da retina. O efeito mais pronunciado do glutamato pode ser devido à sua capacidade de ativar a NOS e também por ativar a eEF-K. De modo interessante, pode-se verificar pelas imagens que, apesar de estar sendo produzido pelos neurônios, o NO também é capaz de ser aprisionado na célula da glia pelo DAF-FM-DA, demonstrando possíveis ações neste tipo celular.