Resumo

Objetivo: A vitamina C é um importante antioxidante encontrado no sistema nervoso central. Sua forma reduzida, Ascorbato (Asc), possui efeito neuroprotetor, enquanto sua forma oxidada, Dehidroascorbato (DHA), pode gerar dano celular. A CREB (proteína ligadora ao elemento de resposta ao AMPc) é um fator de transcrição da família bZIP capaz de ligar ao sítio promotor de genes que contenham CRE (elemento de reposta ao AMPc). A CREB pode ser fosforilada por PKA (proteína cinase A) ou CAMK II ou IV (Calcio-calmodulina cinases 2 ou 4), regulando assim a transcrição gênica. Neste trabalho estudamos a modulação dos níveis de fosfo-CREB (pCREB) por Asc em culturas de células da retina de embrião de galinha. Metodologia: Culturas mistas contendo neurônios e células gliais foram preparadas a partir de retinas de embriões de galinha no oitavo dia de desenvolvimento (E8), que foram dissecadas, dissociadas química e mecanicamente e as células plaqueadas e incubadas a 37ºC em atmosfera com 5% CO2/95% ar. Para os ensaios de morte celular, as culturas foram tratadas com Asc por 24 horas a partir do sétimo dia de cultura (C7), e posteriormente incubadas por 4 horas com MTT (3 mg/mL). Posteriormente as células foram lavadas com Hank’s, lisadas com uma solução ácido-alcoólica, e o material homogeneizado e recolhido. A leitura da viabilidade celular foi realizada em um leitor de ELISA no comprimento de onda de 545 nm. Para detecção dos níveis de fosforilação da CREB, as culturas em C3 ou C4 foram lisadas, submetidas à SDS-PAGE 9%, as proteínas transferidas para membranas PVDF e incubadas “overnight” com anticorpos primários anti-pCREB e anti-AKT. Posteriormente, as membranas foram lavadas com tampão TBS, incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP e reveladas usando-se o kit ECL de quimioiluminescência. O teor de proteínas em cada amostra foi medido pelo método de Bradford. Resultados: Culturas foram tratadas em C7 com diferentes concentrações de Asc (0,5 a 5 mM) e observou-se que na concentração de 1,5 mM a sobrevivência celular era reduzida em 46.4±6,4% (n=3). Também foi observado um aumento significativo nos níveis de pCREB destas culturas a partir de 30 minutos de incubação com Asc 1,5 mM (281,6±57,8%; n=6), mantendo níveis semelhantes em 45 e 60 minutos. Conclusão: Nossos resultados indicam que o Asc modula a sobrevivência celular na retina e que os níveis de pCREB aumentam de forma significativa após o tratamento agudo por Asc.