Resumo

OBJETIVOS: O zebrafish é considerado um modelo para o estudo de diversas doenças humanas, e recentemente o uso desta espécie vem aumentando em estudos abordando o efeito do alcoolismo em parâmetros bioquímicos e comportamentais. Entretanto, não existem estudos relacionados ao efeito crônico da exposição ao etanol no sistema purinérgico desta espécie, onde o ATP extracelular atua como neurotransmissor. Esta molécula é inativada pelas enzimas NTPDase (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e ecto-5’-nucleotidase, produzindo o neuromodulador adenosina. Estas enzimas foram caracterizadas no sistema nervoso central de zebrafish em nosso laboratório. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito crônico do etanol sobre as atividades ectonucleotidásicas. MÉTODOS: Os animais adultos de ambos os sexos foram expostos ao etanol (0,5% v/v) durante 7, 14 e 28 dias. Após o período de exposição, os animais foram imediatamente crioanestesiados de acordo com a aprovação do Comitê de Ética da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul de acordo com o número de protocolo 477/05—CEP. Em seguida as membranas cerebrais foram preparadas como previamente descrito (J. Neurochem. 61:1685-1691, 1993). As frações de membranas cerebrais (3-5 µg de proteína) foram adicionadas à reação que contém 50 mM Tris-HCl (pH 8) e 5 mM CaCl2 para a determinação da atividade das NTPDases ou 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) e 5 mM MgCl2 para a atividade da ecto-5’nucleotidase em um volume final de 200 µl. A quantificação do fosfato inorgânico foi avaliada de acordo o método descrito por Chan (Anal Biochem. 157: 375-380, 1986). A proteína Foi quantificada de acordo com o método de Bradford utilizando albumina bovina sérica como padrão. Cada experimento foi conduzido com pelo menos cinco experimentos independentes, cada um em triplicata e os dados expressos como média ± desvio padrão e analisados por ANOVA, seguido pelo teste de Duncan considerando o nível de significância de 5%. RESULTADOS: A atividade do grupo controle para a hidrólise dos nucleotídeos foi para ATP (504,72 ± 89,81), ADP (198,18 ± 26,84), AMP (34,50 ± 8,82), GTP (140,92 ± 25,11) GDP (33,78 ± 9,14) and GMP (32,67 ± 5,02). Não houve alteração significativa na hidrólise de ATP e GTP em todas as condições testadas. No entanto, foi observada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% and 34%) e GDP (48% and 36%) após 7 e 14 dias, respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, uma significativa diminuição da hidrólise de AMP (48% and 36%) também foi observada, enquanto que a hidrólise de GMP foi inibida somente após 7 dias de exposição (46%). CONCLUSÃO: O estudo sugere que um dos possíveis alvos da prolongada exposição ao etanol é o sistema purinégico. Tais resultados serão importantes para avaliar os mecanismos dos seus efeitos neurotóxicos no sistema nervoso central.