Resumo

Dados prévios do nosso laboratório demonstram que o tratamento com 3nM de ouabaína (OUA) aumenta a sobrevida de células ganglionares, submetidas à axotomia e mantidas em cultura por 48h. Esse efeito é inibido pelo uso de tyrfostina A23, um inibidor do receptor de EGF (EGFR) e pelo PPI um inibidor das proteínas da família Src. Porém, o tratamento com EGF não aumenta a sobrevida das células ganglionares sugerindo que o efeito trófico da ouabaína seja mediado por vias de sinalização distintas daquelas ativadas pelo EGF. Com o objetivo de analisar se o efeito trófico da ouabaína estava relacionado à cinética de ativação dos receptores de EGF e da Src, analisamos neste trabalho o perfil de fosforilação induzido pelo EGF e pela ouabaína tanto do receptor de EGF como da Src. Ratos da linhagem Lister Hooded (P0-P2) foram sacrificados e suas retinas dissecadas em solução salina, tripsinizadas e dissociadas mecanicamente. As células foram plaqueadas em uma densidade de 100.000 céls/cm2 em placas previamente tratadas com poli-L-ornitina e mantidas em cultura por 15 min e 48h. A avaliação da fosforilação de Src e do receptor de EGF foi feita através da técnica de Western blot. Nossos resultados mostram que o tratamento com OUA 3nM por 15 min aumenta a fosforilação do EGFR (CT15min 100%, OUA15min 205,11±27,2% n= 5). Esse efeito é transitório já que o tratamento com OUA 3nM por 48h faz com que a fosforilação do EGFR volte aos níveis do controle (CT48h 100%, OUA48h 124,69±13,40% n=4). Ao analisarmos a fosforilação do EGFR em culturas tratadas com EGF1ng/mL por 15 minutos e 48 horas, observamos a mesma cinética transitória de fosforilação (CT 100%, EGF15min 262,45±11,38%, EGF48h 99,68±2,24%,n=3-5). Analisamos também o perfil da fosforilação da Src após o tratamento das culturas com OUA 3nM e EGF1ng/mL. Nossos resultados mostram que os tratamentos com EGF e OUA por 15 minutos induzem um aumento significativo na fosforilação da Src (CT15min 100%, EGF15min 193,8±17,32%, OUA15min 227,81±19,12%, n=3-5). E os tratamentos por 48h mostram que esse aumento na fosforilação da Src também é transitório (CT48h 100%, EGF48h 120,86±8,42%, OUA48h 110,9±4,26%, n=3-4). Nossos resultados mostram que os tratamentos com OUA e EGF promovem igualmente um aumento transitório na fosforilação da Src e do receptor de EGF. Estes resultados nos permitem concluir que o efeito trófico da OUA, na população de células ganglionares, não esteja relacionado à cinética de ativação deste receptor pela proteína Src.