Resumo

Objetivo: Apesar de estudos prévios demonstrarem a contribuição dos receptores NMDA (NMDAR) em várias doenças degenerativas, como a retinopatia diabética e glaucoma, é possível que vias distintas de sinalização possam ser disparadas de acordo com a presença diferencial das subunidades NR2A-D no receptor, resultando não só na morte como também na sobrevivência neuronal. Além disso, a cascata de sinalização disparada por esse receptor não está completamente elucidada, e existem alguns indícios de que as GTPases Rho possam participar destes processos. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento das subunidades de NMDAR e da GTPase Rac1 na morte de neurônios retinianos. Métodos: Salina tamponada estéril (controle) ou 100nmol de NMDA na presença ou não de 100μM de NSC 23766 (inibidor de Rac1, Calbiochem) e 10µM de Ro 25-6981 (bloqueador da subunidade NR2B, Sigma) (tratados) foram injetados intraocularmente em ratos Wistar (250-350g). A retina foi coletada após 3, 6, 12 e 24h, fixada em PFA 2%-15’ e seccionada em criostato. Cortes de 12μm incubados com anticorpos contra Rac1 ativo (Neweast), Thy1 (Chemicon) e glutamina sintetase (GS) (Sigma) foram revelados com anticorpos conjugados a FITC e TRITC (Jackson Labs.). A morte neuronal foi avaliada pelo método de TUNEL e a análise quantitativa expressa em %±d.p. (n=3-5, Tukey Test, ***P<0,001) em relação ao total de células. Resultados: A apoptose resultante da injeção de NMDA (100 nmol) teve início a partir de 6hs, promovendo um aumento de 42±6%*** de células TUNEL-positivas na camada de células ganglionares em relação ao controle. A administração conjunta de NMDA e Ro 25-6981 (bloqueador de NR2B) foi capaz de reduzir a % de células apoptóticas gerada pelo tratamento com somente NMDA para 12±5%***. Do mesmo modo, o NSC 23766 (bloqueador de Rac1) reduziu a morte para 6±4%***. Quando o anticorpo contra Thy-1 foi utilizado como marcador de células ganglionares, observamos que 48±8%*** dessas células estavam em apoptose após o tratamento com NMDA. O bloqueio de NR2B, assim como o bloqueio de Rac1 foram capazes de reduzir a morte desse tipo neuronal para 10±4*** e 10±2%***, respectivamente. A análise da distribuição de Rac1 ativo na camada de células ganglionares revelou que no grupo tratado com NMDA parece ocorrer um aumento do número de células com Rac1 ativo que é aparentemente reduzido pelo bloqueio de NR2B. A marcação de Rac1 ativo acompanha alguns processos partindo da camada de células ganglionares em direção a plexiforme interna, semelhante aos processos das células gliais de Müller. A co-localização da marcação para Rac1 ativo e glutamina sintetase indicaram que de fato esses processos pertenciam a células gliais de Müller e não a células ganglionares. Conclusões: Até o presente momento, no modelo in vivo de injeção intraocular, verificamos que: 1) a inibição de Rac1 foi capaz de reduzir a morte por NMDA; 2) o bloqueio de NR2B reduz a morte por NMDA; 3.) apesar do bloqueio de Rac1 reduzir a morte de células ganglionares, Rac1 ativo foi vista em células de Müller e não em células ganglionares, revelando assim a possível influência de Müller na morte de células ganglionares.